Wie Photoblau die Mikroskopie stört | EurekAlert! Wissenschaftliche Nachrichten
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BILD: Konfokale Fluoreszenzbilder von Glasoberflächen, die mit Cyaninfarbstoffen Alexa Fluor 647 (a) und CF660C (b) und mit Carborhodaminfarbstoff ATTO647N (c) nach Lichtanregung bei 568 Nanometern beschichtet sind … siehe Nach dem
Bildnachweis: Team Markus Sauer / Universität Würzburg
Die neuesten Entwicklungen in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen es, einzelne Moleküle in Zellen oder Molekülkomplexen mit einer räumlichen Auflösung von bis zu 20 Nanometern abzubilden. Unter bestimmten Umständen tritt jedoch ein Effekt auf, der die Ergebnisse verzerrt: Das verwendete Laserlicht kann zur Bildung hochreaktiver Sauerstoffmoleküle in der Probe führen. Diese können dann die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe so stark schädigen, dass sie nicht mehr fluoreszieren. Unter Mikroskopie-Experten ist dieser Effekt als Photobleichen bekannt.
Verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe können jedoch auch durch Photobleichen transformiert werden, um Licht mit kürzeren Wellenlängen zu absorbieren. “Ein zuvor rot fluoreszierender Farbstoff leuchtet dann grün. Seine Fluoreszenz wurde auf der Wellenlängenskala in Richtung des blauen Bereichs verschoben. Deshalb wird dieser Effekt als Photoblueing bezeichnet”, erklärt Prof. Markus Sauer, Experte für Mikroskopie. Superauflösung des Julius -Maximilians-Universität Würzburg (JMU) Biozentrum in Bayern, Deutschland.
Erste genaue Beschreibung des Photoblues
Sauers Team stellt nun erstmals in der Zeitschrift den genauen molekularen Mechanismus der Photoblauung für Cyaninfarbstoffe wie Cy5 vor Methoden der Natur. Dr. Martin Schnermann vom Zentrum für Krebsforschung in Frederick (USA) ist ebenfalls an der Veröffentlichung beteiligt.
„Weil wir den Mechanismus so genau verstanden haben, konnten wir das Photoblau durch einfache Zusätze wie Vitamin C verhindern oder durch Zugabe eines Katalysators erhöhen“, sagt Markus Sauer.
Das Verhindern von Fotoblau kann sehr wichtig sein. Obwohl der Effekt möglicherweise nur wenige Prozent des verwendeten Farbstoffs beeinflusst, kann er dennoch zu Fehlern oder Fehlinterpretationen in der Mikroskopie führen, beispielsweise bei Energieübertragungsexperimenten (FRET). In der Tat werden die umgewandelten Farbstoffe mit der gleichen hohen Empfindlichkeit wie die Ausgangsprodukte nachgewiesen.
Einfache Pads verhindern das Photobleuing
“Unsere Ergebnisse zeigen, welche Farbstoffe betroffen sind und wie durch einfache Zugabe von Puffer Photoblau vermieden werden kann”, fasst Sauer zusammen. Methoden der Natur Papier. “Sie zeigen aber auch, wie Fotoblau vorteilhaft für die Fluoreszenzbildgebung und zur Verfolgung einzelner, spezifisch umgewandelter Farbstoffmoleküle verwendet werden kann.”
Genau das will das Sauer-Team als nächstes angehen: Photoblueing soll unter anderem zur gezielten Verfolgung einzelner Bakterien- und Viruspartikel bei Infektionsprozessen entwickelt werden.
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